菌種的長(zhǎng)期穩(wěn)定保存是微生物研究與生產(chǎn)應(yīng)用的基礎(chǔ)。若保存不當(dāng)導(dǎo)致菌種失活或遺傳變異，前期實(shí)驗(yàn)成果將可能前功盡棄。甘油冷凍保藏法因操作簡(jiǎn)便、成本低、保存周期長(zhǎng)，成為實(shí)驗(yàn)室中常用的微生物保存方法之一。

作為實(shí)驗(yàn)室耗材專業(yè)服務(wù)商，愛津生物始終致力于為科研人員提供高品質(zhì)、穩(wěn)定可靠的耗材支持，涵蓋菌種保藏、液體操作、細(xì)胞培養(yǎng)等多個(gè)環(huán)節(jié)，助力科研實(shí)驗(yàn)高效開展。

PART 01

甘油冷凍保藏法的優(yōu)勢(shì)

glycerol cryopreservation

01 長(zhǎng)期維持菌種活力

在-80°C或更低溫環(huán)境下，添加甘油可延長(zhǎng)微生物（如細(xì)菌、酵母等）的存活時(shí)間，通?？杀４鏀?shù)年甚至十幾年，為科研和工業(yè)提供穩(wěn)定菌源。

02 降低冰晶對(duì)細(xì)菌損傷

在冷凍過程中，水形成的冰晶會(huì)破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。甘油作為冷凍保護(hù)劑，可從以下三方面發(fā)揮作用：其一，降低溶液的冰點(diǎn)，使溶液在更低溫度下才會(huì)結(jié)冰；其二，減少冰晶的形成，降低冰晶的生長(zhǎng)速度與大?。黄淙?，與水分子結(jié)合，減少可用于形成大冰晶的自由水含量，同時(shí)穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而有效避免細(xì)胞因冰晶形成而受損。

03 保持菌種遺傳穩(wěn)定性

超低溫幾乎阻斷微生物代謝，可有效降低基因突變或漂變的風(fēng)險(xiǎn)，有效維持菌種的原始遺傳特性，是確保實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的重要保障。

04 操作簡(jiǎn)便 適用性廣

甘油冷凍保藏法所需材料常見、且操作步驟已形成標(biāo)準(zhǔn)化流程，新手實(shí)驗(yàn)員也能快速掌握。該方法適用于大多數(shù)細(xì)菌（包括好氧菌和厭氧菌）、酵母菌、部分絲狀真菌以及某些噬菌體，不過對(duì)敏感菌種，可調(diào)整甘油濃度或搭配其他保護(hù)劑（如 DMSO）使用。

05 使用方便 成本經(jīng)濟(jì)

菌種通常以1-2mL的小份量分裝凍存于凍存管中，使用時(shí)只需取出一管進(jìn)行復(fù)蘇，無(wú)反復(fù)傳代或劃線操作，既降低了污染風(fēng)險(xiǎn)，也減少了菌種變異的可能。與液氮保存或商業(yè)化菌種保藏服務(wù)相比，甘油冷凍保藏法的成本更低，具有較高的性價(jià)比。

PART 02

細(xì)菌甘油冷凍保藏操作流程

Operating procedure

所有操作必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行，建議在生物安全柜或超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。

01 準(zhǔn)備工作

配制50% (v/v) 的無(wú)菌甘油溶液是首要步驟。將50mL分析純甘油（建議進(jìn)行高壓滅菌或0.22μm濾膜過濾除菌處理）與50mL無(wú)菌蒸餾水（也可用生理鹽水或培養(yǎng)基）充分混合。盡管甘油本身具有一定抑菌性，但為確保溶液無(wú)菌，滅菌或過濾除菌操作必不可少。

02 菌種準(zhǔn)備

平板法

使用無(wú)菌棉簽或接種環(huán)，從新鮮、健康且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的平板上挑取適量菌苔（約豌豆大?。?，將其懸浮于0.5 - 1mL無(wú)菌生理鹽水或相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，制成濃菌懸液。

液體培養(yǎng)法

將菌種接種到合適的液體培養(yǎng)基（如 LB 肉湯）中，在適宜條件下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液 OD600 達(dá)到 0.6 - 1.0 左右（不同菌種略有差異），即菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期時(shí)，可用于保藏。此階段的菌體生長(zhǎng)狀態(tài)良好，保藏成功率更高。

03 菌液與甘油混合

將制備好的濃菌懸液或?qū)?shù)期菌液與無(wú)菌的50%甘油溶液混合，使最終甘油濃度保持在15% - 20% (v/v) 。例如，取0.6mL 50%甘油與1.4mL菌液混合，可得到2mL含15%甘油的菌懸液；取0.8mL 50%甘油和1.2mL菌液混合，則可獲得2mL含20%甘油的菌懸液?；旌蠒r(shí)需輕柔地上下顛倒或渦旋，確保菌液與甘油充分混勻。

04 分裝與標(biāo)記

迅速將混合均勻的菌液-甘油混合物分裝到無(wú)菌的冷凍保存管中，每管分裝 0.5 - 1.0mL 。同時(shí)，在管壁和管蓋上清晰標(biāo)明菌株名稱 / 編號(hào)、保存日期、甘油濃度、操作者姓名等信息，以便后續(xù)準(zhǔn)確取用和管理。

愛津生物提供多規(guī)格的凍存管，全部采用進(jìn)口醫(yī)療級(jí)聚丙烯（PP）材質(zhì)，具有極高的透明度、無(wú)毒無(wú)味，同時(shí)具備優(yōu)異的密封性和耐化學(xué)性。它不僅能承受121℃/15psi的高溫高壓滅菌，還能在-196℃至121℃的溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，確保實(shí)驗(yàn)安全使用。

05 冷凍保存

可先將凍存管放入-20°C冰箱預(yù)冷1-2小時(shí)，隨后轉(zhuǎn)移至-80°C超低溫冰箱進(jìn)行速凍；也可使用專門的程序降溫盒（如Mr. Frosty）。需避免緩慢冷凍（如在-20°C直接凍存過夜），因?yàn)榫徛鋬鰰?huì)形成較大冰晶，對(duì)細(xì)胞造成損傷。若需長(zhǎng)期保存，可將凍存管置于液氮?dú)庀喹h(huán)境中，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

PART 03

菌種復(fù)蘇

Strain resuscitation

01 快速解凍

從-80°C冰箱取出目標(biāo)凍存管后，立即放入37°C水?。ɑ蜻m合菌種生長(zhǎng)溫度的水?。┲校p輕搖晃，使冰晶在30秒到1分鐘內(nèi)完全融化。避免室溫緩慢融化，以防活性降低。

02 消毒與接種

用70%酒精擦拭凍存管外壁進(jìn)行消毒，在無(wú)菌環(huán)境下打開管蓋，使用無(wú)菌吸頭或接種環(huán)取少量解凍菌液（通常1-2環(huán)或10-50μL），劃線接種到合適的固體平板培養(yǎng)基上，然后在適宜條件下培養(yǎng)。需注意的是，解凍后的菌液不宜再次冷凍，每次使用需取新凍存管，以保證菌種質(zhì)量。

PART 04

注意事項(xiàng)

Points for Attention

01 嚴(yán)格無(wú)菌操作

無(wú)菌操作是保藏成功的關(guān)鍵，任何環(huán)節(jié)的污染都可能導(dǎo)致保藏失敗。

02 控制甘油濃度

15%-20%是常用的甘油濃度范圍，但不同菌株可能需要優(yōu)化。濃度過低，保護(hù)效果不足；濃度過高（超過25%），可能導(dǎo)致細(xì)胞因滲透壓失衡而脫水。

03 選擇合適的菌齡

務(wù)必使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的健康菌體，衰老期的細(xì)胞存活率較低，會(huì)影響保藏效果。

04 把控冷凍解凍速度

快速冷凍（-80℃直接凍或程序降溫）和快速解凍能夠顯著提高菌種存活率，緩慢操作會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷。

05 穩(wěn)定保存環(huán)境

-80℃是標(biāo)準(zhǔn)保存溫度，應(yīng)盡量減少冰箱開關(guān)次數(shù)，避免溫度波動(dòng)。若條件允許，液氮保存效果更佳，但成本相對(duì)較高。

06 考慮菌株特性

并非所有微生物都適合甘油保藏，部分對(duì)低溫或滲透壓敏感的菌株（如某些古菌、專性厭氧菌、部分病原菌），需要采用特殊方法或保護(hù)劑，并嚴(yán)格遵守生物安全規(guī)定，在相應(yīng)級(jí)別的生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。

PART 05

高質(zhì)量保藏，從耗材選擇開始

Consumables Selection

菌種保藏不僅考驗(yàn)操作規(guī)范性，也依賴于高品質(zhì)的實(shí)驗(yàn)耗材。凍存管、移液吸頭、試劑瓶等耗材的性能，將直接影響菌種的活性與后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

自2009年成立以來(lái)，愛津生物專注于實(shí)驗(yàn)室耗材研發(fā)與生產(chǎn)！目前產(chǎn)品體系已涵蓋900余種品類，全面覆蓋菌種保存、分子實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)等科研場(chǎng)景，持續(xù)為全球科研機(jī)構(gòu)提供穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)耗材整體解決方案。